Makacskodó membránfehérjék
A XX. század első felében a fehérjék, a DNS és az RNS, vagyis a biomolekulák gyakorlatilag ismeretlen területnek számítottak a kutatók számára. A tudósok persze tudták, hogy ezek alapvető szerepet játszanak a sejtek működésében, de
A fehérjék szerkezetét először az 1950-es években a Cambridge-i Egyetem kutatóinak sikerült megjeleníteni röntgensugarak, úgynevezett röntgendiffrakció segítségével, és a következő három évtizedben ez jelentette az egyedüli módot a proteinek szerkezetének felderítésére.
Ehhez csatlakozott az 1980-as években a mágneses magrezonancia technikája, amellyel már a fehérjék mozgása és más molekulákkal való interakciói is tanulmányozhatók voltak.
Ennek a két módszernek köszönhetően fehérjék ezreiről készültek olyan szerkezeti modellek, amelyeket ma is napi szinten használnak az alapkutatásoktól kezdve a gyógyszerfejlesztésekig mindenütt.
Mindkét technikának megvannak a hiányosságai
Az NMR csak kisméretű fehérjék esetében használható, a röntgendiffrakció pedig csak olyan proteineknél alkalmazható, amelyek kristályszerkezetbe rendeződnek.
Pontosan ez vezette arra az egyik újdonsült kémiai Nobel-díjast, Richard Hendersont, hogy az 1970-es években egy új képalkotó eljáráson kezdjen dolgozni.
A szakértő a sejtmembránba ágyazódott fehérjék vizsgálatával foglalkozott, munkáját azonban nagyban hátráltatta, hogy ezek a létező módszerekkel gyakorlatilag alig voltak tanulmányozhatók.
A membránfehérjékkel az a probléma, hogy amikor ezeket eltávolítják természetes közegükből, hajlamosak kaotikus csomókká összeállni, innen pedig nagyon nehéz rávenni őket, hogy kristályszerkezetet alkossanak.
Ez Hendersonnak sem sikerült: az első proteinből, amelyet vizsgálni akart, nem tudott eleget begyűjteni a röntgendiffrakciós vizsgálathoz, a második pedig egyszerűen nem akart kristályba rendeződni.
Pusztító elektronok
A csalódott kutató ekkor az elektronmikroszkópia felé fordult, ami azért volt érdekes lépés, mert erről a technikáról kifejlesztése óta többször is bebizonyosodott, hogy
A klasszikus elektronmikroszkóp nagyon hasonlóan működik, mint a fénymikroszkóp, csak fény helyett elektronok haladnak keresztül a mintán. Mivel az elektronnyaláb hullámhossza sokkal rövidebb, mint a látható fényé, a módszerrel jóval apróbb struktúrák jeleníthetők meg, mint a fénymikroszkóppal, és akár egyes atomok is megfigyelhetők általa.
Az elektronmikroszkóp nyújtotta felbontás tehát tökéletes lett volna Henderson számára, csak éppen az eszközt előtte senki sem használta sikeresen biológiai anyagok vizsgálatára. A mintákat átvilágító elektronnyaláb ugyanis annyira intenzív, hogy gyakorlatilag elégeti ezeket, ha pedig a nyalábot gyengébbre állítják, a rendszer nem ad kellően kontrasztos képet.
Az elektronmikroszkópos vizsgálatokhoz továbbá vákuumba kell helyezni a vizsgálni kívánt anyagot, amit a biomolekulák szintén nem viselnek jól, mert kiszáradnak és összeomlanak. Így természetes szerkezetük, amelynek pedig kulcsszerepe van abban, hogyan működnek, nem vizsgálható.
Egy szerencsés választás
Amikor tehát Henderson úgy döntött, hogy elektronmikroszkóppal kezdi tanulmányozni az egyik membránfehérjét, egy olyan eszközhöz nyúlt, amelyet előtte senki sem tudott felhasználni hasonló célra. A sikert végül annak köszönhette, hogy a protein, amelyet vizsgált, nagyon különleges volt.
A kérdéses fehérje, a bakteriorodopszin egy fotoszintetizáló egysejtű sejtmembránjába van beágyazódva, ahol feladata a fényenergia hasznosítása. Henderson a protein eltávolítása helyett, amellyel korábban próbálkozott, egy teljes membrándarabot kezdett vizsgálni az elektronmikroszkóppal, és a kiszáradástól egy cukoroldatos bevonattal igyekezett megóvni a mintát a vákuumban.
Mivel a minta több egyforma fehérjét is tartalmazott, Henderson nem egyetlen célpontra irányította az elektronnyalábot, hanem egy nagyobb átmérőjű, gyengébb nyalábbal világította át a teljes darabot. Így a kép kevésbé lett kontrasztos, de az elemzés során a szakértő és kollégái ki tudták aknázni a bakteriorodopszin egy sajátosságát. Mégpedig azt, hogy
Az eredményül kapott diffrakciós (elhajlási) mintázat alapján a kutatók a röntgendiffrakcióhoz hasonló matematikai modelleket használva részletes képet tudtak kidolgozni arról, hogyan nézhet ki egyetlen ilyen fehérje.
A következő lépésben elforgatták a mintát, és újra képeket készítettek arról. Több felvétel alapján 1975-re Henderson és társai felvázolták a protein térbeli modelljét, amelyen például az is látszott, hogy a bakteriorodopszin összesen hétszer hatol át a sejtmembránon.
Hendersonnak azonban nem volt elég. Röntgendiffrakcióval ugyanis 3 ångströmös felbontást lehetett elérni, és a szakértő meg volt győződve arról, hogy az elektronmikroszkóppal legalább ilyen részletes képek készíthetők.
Hogyan lesz két dimenzióból három?
Ezt végül 15 évvel később, 1990-ben sikerült demonstrálnia, miután kiaknázva az elektronmikroszkópia legújabb fejlesztéseit (köztük azt a fagyasztásos eljárást is, amelyre a későbbiekben térünk ki), atomi pontosságú modellt közölt a bakteriorodopszinról. Henderson módszerével csak egyetlen probléma akadt: az csak olyan fehérjék esetén volt használható, amelyek szabályos rendben sorakoznak a sejtmembránban.
A membránfehérjék többségére pedig nem ez a jellemző, nem is beszélve azon proteinekről, amelyek nem a sejtmembránban találhatók. A nagy kérdés tehát az volt, hogy Henderson úgy gondolta, hogy ez lehetséges, mások viszont képtelenségnek hitték.
Ezen ponton lépett be a képbe a második friss Nobel-díjas, a New Yorki Joachim Frank, aki évtizedeken keresztül dolgozott egy módszeren, amely végül megoldást jelentett a problémára. A szakértő 1975-ben publikált egy elméleti módszert arra, hogyan lehetne az elektronmikroszkópok kétdimenziós képeiből egy nagyfelbontású háromdimenziós képet létrehozni.
A tervet több mint egy évtizedbe került megvalósítani, de végül sikerrel járt. A módszer röviden úgy működött, hogy Frank egy számítógépes program segítségével hasonlóságuk alapján szétválogatta a membránban véletlenszerűen elszórt fehérjék elmosódott képeit, majd az egy kategóriába sorolt felvételekből egyetlen éles képet hozott létre.
Ezt minden homályos foltcsoport esetében megtette, így végeredményül kapott egy olyan sorozatot, amely különböző látószögekből ábrázolta ugyanazt a fehérjetípust. Ezzel 1981-re készült el, majd kidolgozta hogyan tud térbeli modellt csinálni a kétdimenziós felvételekből.
2017 Chemistry Laureate Joachim Frank made the technology to portray biomolecules in 3D at atomic level generally applicable. pic.twitter.com/tNxmBJHvxa
— The Nobel Prize (@NobelPrize) October 4, 2017
Frank az 1980-as évek közepén a módszer révén minden korábbinál részletesebb képet adott közre egy riboszóma, a sejt fehérjegyártó komplexe szerkezetéről.
Jég és üveg
Visszatérve a korábban már említett fagyasztásos eljárásra, ennek kidolgozása a harmadik díjazott nevéhez fűződik.
Jacques Dubochet 1978-ban kezdett dolgozni az Európai Molekuláris Biológiai Laboratóriumban, és feladata az volt, hogy megoldja az elektronmikroszkópok és a biológiai minták alapvető összeférhetetlenségi problémáját, Henderson cukoroldatos megoldása ugyanis csak a vízben nem oldódó molekulák esetében volt használható.
A kutatók ekkor már évek óta próbálkoztak a minták fagyasztásával is, mert a jég lassabban párolog a víznél, a jégkristályok jelenléte azonban teljesen használhatatlanná tette a felvételeket. Dubochet erre azt találta ki, hogy a vizet olyan gyorsan kell lehűteni, hogy jég helyett az üveget jellemző, rendezetlen szerkezetet vegyenek fel a molekulák.
A kutató és kollégái először folyékony nitrogénnel próbáltak vitrifikálni vízcseppeket, de csak akkor jártak sikerrel, amikor az etánt is bevették a folyamatba. Végül az etánt hűtötték le a folyékony nitrogénnel, majd a hideg etánnal révén hűtötték a vizet mínusz 196 °C-ra.
Az így lehűtött vízcseppek a mikroszkóp alatt teljesen újfajta látványt nyújtottak, amikor viszont melegíteni kezdték ezeket, azok gyorsan átrendeződtek a jégre jellemző kristályszerkezetbe.
Cryo-EM makes it possible to portray biomolecules after freezing them very fast (vitrification method) so its natural shape is preserved. pic.twitter.com/SXgeAVUk24
— The Nobel Prize (@NobelPrize) October 4, 2017
Az 1982-es áttörés után Dubochet és társai gyorsan kidolgozták a későbbi krio-elektronmikroszkópia alapjait:
- a biológiai mintákat először vízzel keverték össze,
- majd az oldatot egy sűrű fémhálón terítették szét.
- Ezt aztán nagyon hideg, folyékony etánba mártották,
- így a hálón egy vékony, vitrifikált filmréteg képződött.
1984-ben Dubochet közzétette az első képeket, amelyek az új módszerrel készültek. Ezek különböző formájú vírusokat ábrázoltak, amelyek élesen elváltak a vitrifikált víz hátterétől.
Az eredmények láttán a molekuláris biológiával foglalkozók sorra keresték fel a kutatócsoportot, hogy tanítsák meg nekik az új technikát, amely révén
Fehérjék – akcióban
A krio-elektronmikroszkópia legfontosabb hozzávalói tehát már mind megvoltak, a képek felbontása azonban még mindig nem volt túlságosan jó.
Amikor 1991-ben Frank Dubochet vitrifikált riboszómákról készített képeket saját szoftvere segítségével, a végeredményül kapott háromdimenziós struktúra felbontása 40 ångström volt, ami egy nagyságrenddel elmaradt a röntgendiffrakció nyújtotta felbontástól, így a képen csak a riboszóma elnagyolt körvonalai látszottak.
A következő két évtizedben azonban lassan, de biztosan az új technológia minden elemét sikerült egyre jobbá tenni, így a felbontás folyamatosan javult.
Ez a többi újdonsággal együtt lehetővé tette, hogy immár az egyedi atomok is megjelenjenek a krio-elektronmikroszkóp képein.
Az új technológia a biokémia példátlan fejlődését hozta magával, mivel több okból is optimálisnak bizonyult a biológiai minták vizsgálatára. Egyrészt a vitrifikáció viszonylag könnyen megvalósítható és minimális anyagmennyiség esetén is jól működik. Másrészt a gyors fagyasztással a molekulák akció közben is „elcsíphetők”, így egy-egy folyamat különböző lépései is megjeleníthetők.
Jacques Dubochet, Joachim Frank és Richard Henderson közös munkájának eredményeként a sejt immár minden része atomi pontossággal tanulmányozható. A krio-elektronmikroszkópia megszületése nélkül az idei év orvosi Nobel-díjjal jutalmazott kutatói sem jutottak volna sokra, akik a cirkadián ritmus molekuláris alapjait derítették fel.
és különösen fontossá vált a membránfehérjék szerkezetének és működésének vizsgálatában, amelyek gyakran célpontjai a különféle gyógyszereknek.
Az új módszernek köszönhető továbbá az is, hogy a szakértők rövid idő alatt azonosítani tudták a Zika vírusát, és mostanra teljes képpel rendelkeznek annak szerkezetéről, ami alapvető feltétele az esetleges gyógymódok kidolgozásának.
Atomic structures of a) protein complex that governs circadian rhythm b) pressure sensor of the type that allows us to hear c) Zika virus pic.twitter.com/ixAyJesj99
— The Nobel Prize (@NobelPrize) October 4, 2017
(Forrás: Nobelprize.org, kiemelt kép: Veronica Falconieri, Sriram Subramaniam, National Cancer Institute, National Institutes of Health)
